Proizvodni proces elektroforeze v poliakrilamidnem gelu (PAGE) vključuje predvsem korake, kot so priprava gela, delovanje elektroforeze, barvanje in opazovanje rezultatov.
Priprava gela Priprava ločevalnega gela (10 %): Zmešajte 0 ml ddH₂O, 3 mL 30 % osnovnega gela, 5 mL 5 mol/L Tris-HCl, 1 mL 10 % SDS in 1 mL 10 % AP, dodajte 10 μL TEMED, da zaprete dno, in nato dodajte 4 µL TEMED-a in dobro premešajte. To mešanico vlijte med steklene plošče, vrh zaprite z vodo in počakajte 30–60 minut, da se gel popolnoma polimerizira.
Priprava gela za zlaganje (4 %): Zmešajte 4 ml ddH₂O, 33 ml 30 % osnovnega gela, 25 ml 1 mol/L Tris-HCl, 0,2 ml 10 % SDS in 0,2 ml 10 % AP, dodajte 2 μL TEMED in takoj dobro premešajte. Odlijemo vodo na ločilni gel, dodamo to mešanico in takoj vstavimo glavnik med steklene plošče ter počakamo 15-30 minut, da se zlagalni gel popolnoma polimerizira.
Postopek elektroforeze Obdelava vzorca: vzorec zmešajte z enako količino polnilnega pufra 2XSDS, segrevajte pri 100 stopinjah 3-5 minut in nato 1 minuto centrifugirajte pri 12.000 obratih na minuto ter vzemite supernatant za analizo SDS-PAGE.
Nalaganje: Vzemite 10 μL induciranih in neinduciranih vzorcev in jih dodajte v skupino vzorcev ter dodajte 20 μL standardov beljakovin z nizko molekulsko maso kot kontrolo.
Elektroforeza: dodajte 1X pufer za elektroforezo v posodo za elektroforezo, priključite napajalnik, vzdržujte napetost gela za zlaganje pri 60 V in napetost gela za ločevanje pri 100 V. Ko bromofenol modro doseže dno posode za elektroforezo, prekinite elektroforezo (približno 3 ure).
Barvanje in opazovanje rezultata
Barvanje: Odstranite gel s steklene plošče in ga obarvajte z raztopino za barvanje Coomassie Brilliant Blue 4 do 6 ur pri sobni temperaturi. Razbarvanje: Obarvani gel postavite v raztopino za razbarvanje in ga večkrat razbarvajte, dokler ni jasno viden proteinski pas. Opazovanje rezultatov: Po razbarvanju lahko gel fotografiramo in shranimo. Ko je korak razbarvanja končan, postavite gel pod sistem za obdelavo slik za fotografiranje in shranite rezultate na disketo.